Estudo da viabilidade de embriões bovinos pós-biópsia e da amplificação de todo o genoma: modelo experimental para a realização do diagnóstico pré-implantação (PGD)
O impacto da técnica de biópsia sobre o desenvolvimento embrionário posterior ainda foi pouco estudado e também não foi estabelecido um protocolo único e universal para o PGD. Outro ponto a considerar é a pequena quantidade de DNA genômico disponível para se realizar os estudos genéticos, pelo númer...
| Author: | |
|---|---|
| Format: | Master's thesis |
| Status: | Published version |
| Publication date: | 2008 |
| Country: | Brasil |
| Institution: | UFJF |
| Repository: | Repositório Institucional da UFJF |
| Language: | Portuguese |
| OAI Identifier: | oai:hermes.cpd.ufjf.br:ufjf/2826 |
| Online Access: | https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/2826 |
| Access Level: | Open access |
| Keyword: | CNPQ::CIENCIAS DA SAUDE::MEDICINA PGD Sexagem Qualidade embrionária Taxa de eclosão Sexing Embryo quality Hatching rate |
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| author | Polisseni, Juliana |
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| description | O impacto da técnica de biópsia sobre o desenvolvimento embrionário posterior ainda foi pouco estudado e também não foi estabelecido um protocolo único e universal para o PGD. Outro ponto a considerar é a pequena quantidade de DNA genômico disponível para se realizar os estudos genéticos, pelo número reduzido de células obtidas pela técnica de biópsia. Metodologias que utilizam whole genome amplification (WGA) vêm sendo desenvolvidas. Utilizando este método é possível gerar microgramas de DNA partindo de pequenas quantidades de DNA. Então, o objetivo deste estudo foi avaliar o desenvolvimento de embriões bovinos submetidos à biópsia nos estádios de 8-16 células e o uso da técnica de amplificação de todo o genoma nos blastômeros retirados, para posterior identificação do sexo através do PCR. Um grupo de 706 complexos cumulus-ovócitos (CCOs) de bovinos foram maturados e fertilizados in vitro, em estufa incubadora a 38,8 °C, 95% de umidade e 5% de CO2. Os prováveis zigotos foram semi-desnudados e cultivados no meio CR2aa sob as mesmas condições da fertilização. No quarto dia após a fertilização, embriões bovinos com 8-16 células foram aleatoriamnte distribuídos entre dois grupos: controle (n=103) e biópsia (n=92). O número de células removidas correspondeu à quarta parte do embrião. Os blastômeros retirados foram submetidos à amplificação de todo o genoma seguido por PCR. Os embriões retornaram ao meio de cultivo para avaliação do desenvolvimento embrionário. Avaliou-se pelo teste do qui-quadrado a produção de blastocisto no oitavo dia de cultivo, a taxa de eclosão no décimo dia de cultivo, a eficiência da amplificação de todo o genoma e da identificação do sexo nos blastômeros removidos. O número de células embrionárias foi analisado por análise de variância ANOVA (Instituto SAS, Inc., Cary, NC, USA). A proporção de blastocisto no oitavo dia de cultivo foi avaliada pelo teste de Wilcoxon. Diferenças foram consideradas significantes se P<0,05. Um total de 92 embriões bovinos foi utilizado para realização da técnica de biópsia e apresentaram produção de blastocisto de 53,3%, com 44,9% de taxa de eclosão. Essas taxas foram semelhantes (P>0,05) às dos 103 embriões do grupo controle (66,0% e 42,6%, respectivamente). Não houve variação no número de células embrionárias entre os grupos e também não ocorreu diferença na proporção de blastocisto entre os grupos controle e biópsia no oitavo dia de cultivo (P>0,05). Os blastômeros retirados foram submetidos à amplificação de todo o genoma, com 98,2% de eficiência. Entretanto, só foi possível identificar o sexo em 59% das amostras. Conclui-se que a técnica de biópsia realizada em embriões bovinos de 816 células não afetou o desenvolvimento embrionário subseqüente nem a qualidade embrionária dos embriões. A utilização do kit de amplificação de todo o genoma mostrou-se eficiente nos blastômeros retirados, sendo possível identificar o sexo em mais da metade dos embriões. . |
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| spelling | Estudo da viabilidade de embriões bovinos pós-biópsia e da amplificação de todo o genoma: modelo experimental para a realização do diagnóstico pré-implantação (PGD) Polisseni, Juliana Peters, Vera Maria Sá, Wanderlei Ferreira de Guerra, Martha de Oliveira CNPQ::CIENCIAS DA SAUDE::MEDICINA PGD Sexagem Qualidade embrionária Taxa de eclosão Sexing Embryo quality Hatching rate O impacto da técnica de biópsia sobre o desenvolvimento embrionário posterior ainda foi pouco estudado e também não foi estabelecido um protocolo único e universal para o PGD. Outro ponto a considerar é a pequena quantidade de DNA genômico disponível para se realizar os estudos genéticos, pelo número reduzido de células obtidas pela técnica de biópsia. Metodologias que utilizam whole genome amplification (WGA) vêm sendo desenvolvidas. Utilizando este método é possível gerar microgramas de DNA partindo de pequenas quantidades de DNA. Então, o objetivo deste estudo foi avaliar o desenvolvimento de embriões bovinos submetidos à biópsia nos estádios de 8-16 células e o uso da técnica de amplificação de todo o genoma nos blastômeros retirados, para posterior identificação do sexo através do PCR. Um grupo de 706 complexos cumulus-ovócitos (CCOs) de bovinos foram maturados e fertilizados in vitro, em estufa incubadora a 38,8 °C, 95% de umidade e 5% de CO2. Os prováveis zigotos foram semi-desnudados e cultivados no meio CR2aa sob as mesmas condições da fertilização. No quarto dia após a fertilização, embriões bovinos com 8-16 células foram aleatoriamnte distribuídos entre dois grupos: controle (n=103) e biópsia (n=92). O número de células removidas correspondeu à quarta parte do embrião. Os blastômeros retirados foram submetidos à amplificação de todo o genoma seguido por PCR. Os embriões retornaram ao meio de cultivo para avaliação do desenvolvimento embrionário. Avaliou-se pelo teste do qui-quadrado a produção de blastocisto no oitavo dia de cultivo, a taxa de eclosão no décimo dia de cultivo, a eficiência da amplificação de todo o genoma e da identificação do sexo nos blastômeros removidos. O número de células embrionárias foi analisado por análise de variância ANOVA (Instituto SAS, Inc., Cary, NC, USA). A proporção de blastocisto no oitavo dia de cultivo foi avaliada pelo teste de Wilcoxon. Diferenças foram consideradas significantes se P<0,05. Um total de 92 embriões bovinos foi utilizado para realização da técnica de biópsia e apresentaram produção de blastocisto de 53,3%, com 44,9% de taxa de eclosão. Essas taxas foram semelhantes (P>0,05) às dos 103 embriões do grupo controle (66,0% e 42,6%, respectivamente). Não houve variação no número de células embrionárias entre os grupos e também não ocorreu diferença na proporção de blastocisto entre os grupos controle e biópsia no oitavo dia de cultivo (P>0,05). Os blastômeros retirados foram submetidos à amplificação de todo o genoma, com 98,2% de eficiência. Entretanto, só foi possível identificar o sexo em 59% das amostras. Conclui-se que a técnica de biópsia realizada em embriões bovinos de 816 células não afetou o desenvolvimento embrionário subseqüente nem a qualidade embrionária dos embriões. A utilização do kit de amplificação de todo o genoma mostrou-se eficiente nos blastômeros retirados, sendo possível identificar o sexo em mais da metade dos embriões. . The impact of biopsy technique on posterior embryo development is still poorly studied and there is no single universally practiced protocol for implementing PGD. Another thing to consider is the small amount of genomic DNA available to perform the genetic study, due to the reduced number of cells obtained from the biopsy. Alternatively, methodologies using whole genome amplification (WGA) have been developed. Using these methods, it is possible to generate microgram quantities of DNA starting with a little genomic DNA. The aim of this study was to evaluate the effect of biopsy at 8-to 16-cell bovine embryos on subsequent development and WGA on removed blastomeres. A group of 706 complexes cumulus oocytes (CCOs) obtained from local slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro, in incubator at 38.8°C with 95% humidified air and 5% of CO2. The zygotes were semidenuded and cultured in CR2aa medium under the same conditions as with in vitro fertilization. On the fourth day after fertilization the 8-to 16-cell embryos were distributed randomly across two groups: control (n=103) and biopsy (n=92). The amount of cells removed cells was one-fourth the embryo of blastomeres. The removed blastomeres were submitted to whole genome amplification (WGA) followed by PCR. The embryos were returned to culture for development evaluation. The chisquare test was used for statistic evaluation of the results of blastocyst rate on the eight day after fertilization and hatching rate on tenth day between biopsy and control group, to test the WGA efficiency and to determine the sex proportion of biopsied samples submitted to PCR. The number of cell per embryo was analyzed by ANOVA with SAS (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA). The blastocyst proportion was evaluated with Wilcoxon test. Differences were considered significant if P<0.05. A total of 92 embryos were submitted to biopsy technique. The blastocyst production was 53.3%, with 44.9% of hatching rate. This rate was similar to control group (66.0% and 42.6%) found on 103 embryos. Overall, no impact was detected on embryo quality in blastocyst cell number between the two groups. The proportion of blastocyst in different stages of development on the 8th day did not differ among groups (P>0.05). Removed blastomeres were submitted to WGA, resulting in 98.2% of efficiency. However, only 59% of samples were sexed by PCR. In conclusion biopsy of 8-to 16-cell bovine embryos did not affect subsequent development. WGA was successful in removed blastomeres and was possible to determinate the sex in the samples. Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) Programa de Pós-graduação em Saúde Brasileira UFJF Brasil Faculdade de Medicina https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/2826 |
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